产前压力损害了女性后代的造血干细胞(HSC)的形成

1. 引言

   高度易感的感染或导致哮喘和过敏的过度反应免疫影响着大量儿童，成为主要的全球健康问题。免疫细胞、红细胞和血小板通过所谓的造血过程发展，该过程始于产前，并在从无菌的子宫到富含微生物的世界的过渡中赋予后代免疫力。出生后，免疫发展继续变得更为复杂，反应也变得更为精细。其缺陷，在受到损害或免疫过度反应的儿童中，已经与多个因素相关，如出生方式和胎龄、母乳喂养，以及更近期的产前压力暴露。事实上，我们的团队和其他团队都能证明产前压力挑战与人类儿童时期哮喘和过敏的风险增加有关。令人震惊的是，有证据支持产前压力与人类自身免疫性疾病的风险之间存在关联，以及与早期生活感染有关。尽管有这种日益认识，但确定与产前压力和产后免疫之间的关联有因果关系的途径在很大程度上仍然缺失。基于这些证据，可以提出胎儿免疫器官可能是产前压力挑战的一个易受伤害的目标，这可能导致损害的胎儿免疫发展，在儿童时期表现为感染的高风险和慢性免疫疾病的发病。

   重要的是，造血干细胞（HSCs）通过个体的生命自我更新，并由于其多功能性不断提供所有免疫细胞组分。这些细胞在人类的胎儿期和小鼠的围生期大部分都已形成。HSCs在胎儿骨髓中定位后，建立了明确的造血以进一步在系列特异的分化过程中生成免疫细胞。最近已经认识到，个体的HSCs具有很大的异质性，并且可能产生有系列偏见的子代，而不是传统的分步二分化的细胞命运承诺。尽管如此，HSCs逐渐分化为淋巴系和髓系亚群仍受到大量生长因子严格调节，并涉及广泛的表观遗传重塑。的确，表观基因组的变化是文献中描述的关键因素，驱动系列决策。有趣的是，由于DNA合成广泛，表观基因组在发育过程中尤其容易受到挑战。迄今为止，已经在几种组织中研究了母亲应激对后代DNA甲基化剖面的影响，包括脐带血细胞。然而，HSPC表观基因组是否特别受到影响，从而对预期的细胞子代产生后果，仍然不知道。重要的是，新近的文献研究了HSC功能缺陷（例如，与自我复制和/或增强的细胞耗竭有关）与包括免疫反应和癌症在内的病理过程之间的关联。

   在这种背景下，我们假设由于造血干细胞部位早期生活的变化，孕前应激暴露在后代免疫上引起的长期变化是通过介导的。因此，我们的目的是研究造血级联包括系列承诺是否受到孕前应激的调节，以及这些效应是否随时间持续存在，例如通过损害造血干细胞和祖细胞（HSPC）的表观基因组。我们观察到的翻译相关性在人群队列中的脐带血细胞中进行了测试。

2. 材料和方法

   • 人类研究设计，样本收集和分析

     在大学医学中心从2011年开始进行的研究中收集了分析的数据和样本。简而言之，纳入标准是母亲年龄在18岁或以上，并且在妊娠周12-14具有可行的单胎妊娠。慢性感染（HIV，乙型/丙型肝炎）、已知的物质滥用、吸烟、多胎妊娠或在辅助生殖技术后怀孕的女性被排除在外。符合条件的孕妇在签署知情同意书后被邀请参加三次产前检查，每个孕妇一次（妊娠周12至14，24至26和34至36）。每次，使用所谓的Perceived Stress Scale（PSS）评估个体的压力水平，该量表的得分在0（低）-40（高）之间。

     在本次研究中，仅包括出生时采集了脐带血的研究参与者（共134人）。脐带血样本在分娩后24小时内进行处理。简而言之，取50微升全血与荧光染料结合的抗体染色，然后通过流式细胞术进行分析。其中，怀孕期间未记录与PSS评分匹配的样本被排除，最终得到93个脐带血样本。根据怀孕期间的压力水平，样本被分类为轻度至中度压力（PSS评分<20；共30个）或高度压力（PSS评分>23；共45个）。那些PSS评分处于这两个阈值之间的女性样本由于结果变化较大而被排除在分析之外。

   • 小鼠

     成年雄性和雌性的C57BL/6及雄性Balb/c小鼠在医学中心动物设施内按12小时光暗循环饲养，可以随时取食和饮水。

   • 计时怀孕和母体压力暴露

     8周大的C57BL/6雌鼠与Balb/c雄鼠进行异种交配。在骨髓移植实验中，C57BL/6雌鼠和雄鼠进行交配。早上检测到阴道栓被认为是怀孕日(gd)0.5。然后将怀孕的雌鼠分为2组。第一组在怀孕期间除了在gds 11.5、13.5和15.5记录体重外，没有受到干扰，因此作为对照。第二组则按照我们已发表的产前压力协议进行处理。简而言之，雌鼠在gds 10.5、12.5和14.5这些天暴露于声音压力24小时。声音压力是由放置在压力笼内的驱鼠设备产生的，这些设备发出88分贝、频率为1200赫兹的声音，每15秒间隔或连续发出超声波。

   • 骨髓移植

     为产生骨髓嵌合小鼠，从8周大的产前受压挑战和对照的C57BL/6 CD45.1+供体小鼠中分离出的1000万个骨髓细胞被通过眼窝后静脉注射入10周大的产前受压挑战和对照的C57BL/6 CD45.2+受体中。注射是在全身辐射(10 Gy)后的12小时进行的。移植后5周，通过流式细胞术检测受体的外周血样本中的CD45.1+供体免疫细胞，确认了CD45.2+受体后代的骨髓造血功能的成功重建。移植后9周，动物被处死以研究骨髓造血。

   • 组织收集和处理

     在E18.5日，对照组或产前受压挑战的怀孕小鼠及相应的胎儿在CO2/O2吸入后经颅骨切除处死。尾部活检标本被收集用于PCR检测SRY序列以确定胎儿性别。胎儿的股骨和胫骨被机械破碎并过滤通过一个细胞筛，以获得单细胞骨髓细胞悬浮液。第二批怀孕的小鼠被允许分娩。三周后，幼仔与母鼠分开并保持不受干扰，直到达到8-9周大。

     成年后代和骨髓嵌合小鼠在CO2/O2吸入后迅速处死。从股骨和胫骨中冲刷骨髓，随后进行红细胞裂解以生成单细胞悬浮液。

   • 流式细胞术和细胞分选

     骨髓细胞（胎儿个体的总量，来自成年骨髓嵌合小鼠）按照我们的标准协议进行染色。尽管如此，对于造血细胞的确定，在与抗体混合物孵化之前，没有使用Fc块以允许抗CD16/32表位的抗体结合。使用LSR Fortessa流式细胞计(BD)获取样本。

     对于细胞分选，3个性别匹配的后代的样本被混合并按照通常的方法染色。用于甲基组分析的骨髓HSPC细胞使用FACSAria细胞分选机(BD Bioscience)进行分离。细胞悬浮液的纯度通过后续的流式细胞术得到确认。

   • 甲基化的DNA免疫沉淀测序

     近期发布的文献中描述了如何进行甲基化的DNA免疫沉淀 (MeDIP)，通过短读取测序来识别富含甲基化的DNA区域。简要地说，从10-11周大的MMc+ 和MMclow后代的骨髓中分选出HSC。从1.5×105的HSC中提取基因组DNA，将细胞悬浮在300µl的裂解缓冲液 (7.5% NaHCO3) 中，通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀。利用Bioruptor (Diagenode) 对分离的基因组DNA进行超声波断裂，平均碎片大小为50-100bp。作为质控，每个样本中都添加了0.025ng从体外甲基化的pCR2.1质粒DNA作为内标(as a spike-in control)。DNA在98°C下变性10分钟并在冰上冷却10分钟。每个样本的1/10总量被用作输入对照。为了进行MeDIP沉淀，向样品的其余部分添加了5µg的5-mc-specific抗体 (Diagenode)，在4°C下旋转2小时。随后，加入50µl的M-280抗小鼠IgG Dynabeads，并在旋转轮上于4°C孵育2小时。以下步骤与输入样本并行进行。使用1.3µl的RNAse A (20–40mg/ml)在37°C下进行RNA消化30分钟，然后使用200µl的洗脱缓冲液 (50mM Tris-HCl, 10mM EDTA 和 1% SDS)、4µl的蛋白酶K (40mg/ml) 和 7µl的CaCl2 (300mM)在55°C下消化蛋白30分钟。如上所述，使用苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀法提取DNA。

     使用5ng DNA和适合单链DNA的DNA SMART ChIP-Seq Kit (TaKaRa, Clontech, Cat-No.: 634865)生成与MeDIP兼容的下一代测序文库。在NextSeq 500系统 (Illumina, Cat-No.: 20024906)上对MeDIP文库进行测序，使用单读取 (1×75) 流细胞，每个MeDIP样本30百万次读取，每个输入对照10百万次读取。

     在对MeDIP-seq数据进行质量控制后，使用FASTQC75进行检查，使用BWA76将reads对齐到MM10基因组，生成BAM文件。使用IGV软件分析对齐文件。为了检测差异甲基化区域 (DMRs) 和基因本体分析，使用了diffreps77工具。除了将窗口大小调整到800 nt，其它使用默认参数。使用IGV分析具有显著DMRs (P值<0.0001, G-test) 的基因。在WebGestalt中，按照它们的生物学功能分类了显著上调 (高甲基化, log2FC>1, p-adj. <0.05) 或下调 (低甲基化, log2FC<-1, p-adj. <0.05) 的差异甲基化基因 (参见补充图6c)。sam2bedgff.pl, deepTools bamCoverage 和 circus软件支持了进一步的分析 (见代码可用性)。

   • 统计分析

     统计分析是使用Prism 9软件进行的。使用双因子方差分析（因子：应激暴露和性别）来比较结果。只要方差分析是显著的（应激暴露因子或应激和性别的交互作用 p < 0.05），就运行Sidak的多重比较测试，以比较应激对性别匹配后代的影响。在图中已标出显著的值。

3. 结果

   • 产前压力损害了胎儿在子宫生活中造血干细胞和祖细胞（HSPC）的形成

   • 母亲的压力也影响到早期子代的HSPC丰度

   • 来自产前受压应激者的HSPC保留了受损的再生能力

     接下来，我们计划研究产前应激对胎儿骨髓HSPC部位的短期影响是否会在成年时产生后果。为此，用来自成年对照或产前应激受挑战的后代的骨髓细胞移植给致命照射的未受扰动的C57BL/6小鼠（图3.A）。移植后重建骨髓造血功能时，像之前一样确定了HSPC。与相应的性别匹配对照相比，携带产前受压应激后代HSPC的移植小鼠中，LTHSC的频率减少（anova因子应激p < 0.05）（图3.B）。这些事后比较未达到统计学意义，可能是由于实验的n值适中（n = 4-5）。携带受压HSPC的骨髓嵌合小鼠倾向于减少STHSC，但没有达到统计学意义。其他调查的HSPC亚群，即MM2、3和4、CMP、GMP、MEP和CLP，与移植了来自对照或产前应激后代的HSPC的小鼠之间没有差异（图3.C-F），无论它们的移植与HSPC来源于对照还是产前受压应激的后代（anova因子应激/应激和性互作> 0.05）。

   • 在产前受压应激的小鼠中，改变的甲基化模式作为HSPC的长期机制

     DNA甲基化不仅作为一种重要的表观遗传机制来稳定地从一个细胞传递信息给它的后代，而且它还参与HSPC向各种血细胞系列的分化。因此，我们计划调查来自产前应激后代的HSPC中受损的再生能力是否与在成年期保持的改变的表观遗传特征有关，方法是对纯化的HSPC进行甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-Seq）（补充图1）。值得注意的是，可以在产前应激挑战后代与对照之间的HSPC基因组中鉴定差异甲基化区域（DMR）（图4.A,B）。在女性后代中，这些变化更为明显。实际上，产前受压应激的女性后代不仅比男性呈现出更多的DMR，这些也更经常定位在启动子区域。来自产前受压应激女性的HSPC中的DMRs通常显示出增加的甲基化（高甲基化），而在产前受压应激的男性中，DMR在超甲基化和低甲基化之间更均匀地分布。在基因启动子中也观察到这种模式，其中高甲基化与转录活性的丧失和基因失活有关。特别是，参与抑制髓系细胞分化的C1qc和在增殖的HSCs中表达的Hoxa5基因的启动子在女性中呈现高甲基化。值得注意的是，在产前受压应激的女性HSPC样本中，还观察到基因体区域的高甲基化，这与转录抑制无关，而是与差异的mRNA剪接和/或转录延长有关。

4. 讨论

   在我们目前的研究中，我们观察到产前应激损害了骨髓HSC部位的形成，特别是影响了雌性小鼠。这一效应高度保守，因为在来自在怀孕的第一到第二个孕期经历高压的女性所生的女性婴儿的脐血中，HSPC也减少了。在成年期，来自产前受压应激的小鼠后代的骨髓细胞未能完全重建LTHSC部位，与性别无关。这可能与产前应激挑战显著影响HSPC甲基组的事实有关。变化是性别特异的，而在产前受压应激的雌性中，与转录下调相关的基因启动子的高甲基化被产前应激所诱导，而在产前受压应激的雄性中，DMRs的低甲基化和高甲基化平衡。综上所述，我们的结果强调，产前应激暴露可以显著影响生命早期的HSPC部位，对成年期产生长期的重大影响。

   我们研究的胎儿生活时间与小鼠骨髓中确定性造血的早期步骤相吻合。尽管胎儿肝脏中的HSPC开始在E 15.5-17.5迁移到骨髓，但只有接近出生时（约E 18.5-19），骨髓HSC才获得多能性，这受到特定的转录特性的支持。之后，HSCs继续增殖，直到他们在出生后的几周进入静止状态。我们的结果显示，尤其是在产前受压应激的女性后代中，E18.5骨髓细胞的数量减少，尤其是LTHSC，提供了这一过程连续性的一个快照。事实上，这些短期变化已经可以在HSC发展的这些初始点观察到，这突显了它们在胎儿期编程的新生免疫中的参与，不考虑产前应激可能对分娩时微生物群的定植和早期母亲的养育行为的影响。这很重要，因为虽然现在很明确产前应激暴露与出生时免疫变化有关，但这是否源于HSC部位的变化则不太被理解。只有在不同的产前侵害的情况下，已经发现产前事件与改变的HPSC形成和/或功能之间存在联系。其中，产前对乙酰氨基酚的消耗减少了小鼠胎儿肝脏中的HSPC并倾向于减少与对照组相比的人脐血中的HSPC计数。相反，用于模拟小鼠产前感染的母亲免疫激活表明，炎症触发了胎儿肝脏HSPC的增殖，增强了MMP4和髓系细胞的生成。

   ...

   迄今为止，产前应激对HSPC甲基化及其在人类或动物模型中的后果的影响研究得很少。产前应激没有引起雄性或雌性后代HSPC的DNA甲基化模式的剧烈破裂，这种模式保持得非常稳定。然而，以200-1000 bp的分辨率比较甲基化区域发现，应激永久性地影响了成年后代HSPC的甲基化配置文件，这可能对它们的自我更新、多能性或其他特性产生影响。在人类中，母亲应激的各种代理，如焦虑、情感障碍或暴露于家庭暴力，都与后代的DNA甲基化改变有关。这在免疫组分中也是明显的，例如在人类青春期T细胞和脐带血白细胞中，其中糖皮质激素受体基因经常被发现高甲基化。我们的结果为这些观察提供了依据，因为应激对HSPC甲基组的印迹可能传递给后代，包括血液的所有细胞组分。与人类的观察相反，我们的数据集没有显示糖皮质激素受体基因Nr3c1的甲基化配置文件有任何显著的变化。但是，我们确实观察到与造血和免疫相关的基因的启动子发生变化。其中，产前应激的雌性的HSPC显示出Hoxa5（同源盒5）和C1qc基因的启动子高甲基化。Hoxa5在HSPC中优先表达，并在分化为MPP时下调，这可能表明成年HSPC骨髓细胞中减少的HSC标志。此外，Hoxa集群的基因的激活是HSPC增殖和再生的先决条件，其中Hoxa5在它们的扩展期间上调。因此，我们不禁猜测Hoxa5启动子的高甲基化可能与表观遗传约束扩展有关，如我们的骨髓移植实验中所观察到的，或可能在胎儿生活中。C1qc参与抑制髓样细胞分化，因此其启动子的高甲基化和预期的C1qc的失活可能导致分化偏向增加CMPs，如在胎儿小鼠中所观察到的，但不是在成年骨髓嵌合体中。

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