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Tags: research, sequencing
摘要
自现代转座子插入测序(TIS)方法引入以来已有10年的时间了。这些方法结合了全基因组转座子突变和高通量测序,用于估计细菌基因组中每个遗传组分的适应性贡献或必需性。2009年,发布了四种TIS变体:转座子测序(Tn-Seq)、转座子定向插入位点测序(TraDIS)、插入测序(INSeq)和高通量插入跟踪深度测序(HITS)。此后,TIS已成为分子微生物学家的重要工具之一,它是少数直接将表型与基因型联系起来并最终能够指派基因功能的全基因组技术之一。在本综述中,我们讨论了TIS最近应用于回答重大生物学问题的情况。我们还探讨了基于TIS的新兴和跨学科方法,着眼于未来的应用前景。
引言
转座子插入测序(TIS)方法结合了大规模转座子突变和下一代测序技术,以同时估计细菌基因组中每个遗传特征的必需性和/或适应性贡献。TIS的一个优势在于,实验是使用混合的转座子文库进行的,这使得能够以高通量的方式直接将表型与基因型联系起来。TIS的最终目标是阐明每个基因组特征的功能,因此是帮助解读不断增加的基因组测序数据的关键工具。在足够的密度下,TIS方法不仅对检测突变体适应性的微小变化足够敏感,而且足够精确,能够检验基因以及基因间区域、启动子区域和编码区域内的必需蛋白质域。2009年,公布了四种TIS方法的变体:转座子测序(Tn-Seq)、转座子定向插入位点测序(TraDIS)、插入测序(INSeq)和高通量插入跟踪深度测序(HITS)。自那以后,TIS已成为我们分子生物学工具包中的宝贵工具,其全部用途仍在探索中。
TIS工作流程的基本过程概述在图1中。简而言之,它开始于构建饱和突变体文库(图1A),方法是通过转化或接合等方式将随机插入的转座子(通常是Tn5或mariner转座子)引入感兴趣的菌株中。目标是创建一个细菌群体,其中每个细胞在基因组中携带一个单一的转座子插入,当细胞混合在一起时,每个遗传组分在不同的位点被多次破坏。通过直接测序初始文库中转座子侧翼区域,可以识别那些不容许插入的潜在必需特征。或者,可以将文库置于选择性条件下,例如抗生素应激(图1B),以查询在该环境中生存和生长所涉及的非必需特征。这些条件重要组分是通过插入频率在选择过程中显著变化而定义的,这是通过在选择前后进行测序确定的。在实验选择中频率降低的具有破坏性转座子插入的基因组特征被认为对适应性重要;这些特征可能包括在抗生素选择期间的抗生素抗性基因或在感染模型中的毒力因子。插入频率增加的特征被认为在测试条件下具有不利影响,包括对增强适应性特征的负调控因子,或在那些条件下不必要的代谢成本高昂的系统。
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