基因编辑技术的比较

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Tags: research, technique

siRNA沉默: siRNA沉默是一种利用小干扰RNA(siRNA)来降低特定基因表达的方法。siRNA与目标mRNA序列特异性结合,导致mRNA被切割和降解,从而减少相应蛋白的产生。

  • 这是一种“转录后沉默”方法,因为它在mRNA水平上阻止基因表达,而不改变DNA序列本身。
  • siRNA沉默通常是临时的,只在siRNA存在时有效。
  • CRISPR+guideRNA:

CRISPR+guideRNA是一种基因编辑技术,利用CRISPR-Cas9系统通过导向RNA(guideRNA)找到并切割特定的DNA序列。这种切割可以导致DNA的修复机制启动,并在切割位点引入突变,从而永久改变基因的序列。

  • 这是一种“基因组水平”的编辑,因为它直接改变DNA序列,这种改变是永久性的。
  • CRISPR技术可以用于敲除(完全关闭基因表达)、敲入(引入新的基因序列)或修正(改变现有的基因序列)特定基因。
  • 可以将siRNA沉默和CRISPR+guideRNA总结为基因编辑技术,但它们在目标和持久性上有显著区别。

在CRISPR+guideRNA系统中,基因敲除(knockout)通常遵循以下步骤来实现目标基因的失活:

  • 设计导向RNA (guide RNA, gRNA):首先,需要设计一个与目标基因特定区域(通常是编码区或功能区)互补的gRNA。gRNA的设计至关重要,因为它决定了CRISPR系统的Cas9酶将在哪里切割DNA。gRNA需要高度特异性,以避免在非目标位点发生切割(即“脱靶效应”)。
  • 构建CRISPR-Cas9载体:将gRNA和Cas9酶的编码序列克隆到适当的载体中。这个载体可以是质粒、病毒或其他传递系统,依据实验的类型和目标细胞类型而定。
  • 细胞转染:将CRISPR-Cas9载体引入目标细胞。这可以通过多种方法完成,包括电穿孔、脂质体介导转染、病毒载体传递等。
  • DNA切割和修复:一旦进入细胞,Cas9酶会被gRNA引导到目标DNA序列,并在该位置产生双链断裂(DSB)。细胞会尝试修复这种断裂,主要通过两种机制:非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。NHEJ过程常常不精确,通常会在断裂点引入插入或缺失(indels),从而破坏目标基因的读码框,导致功能性基因产物的缺失。
  • 筛选和验证:筛选已经转染的细胞,以找到那些成功进行基因敲除的细胞。这通常涉及PCR、测序、蛋白表达水平分析等方法来验证gRNA和Cas9是否成功地敲除了目标基因。
  • 功能分析:一旦确认基因已被成功敲除,接下来就是评估这种基因失活对细胞功能的影响。这可能包括观察细胞生长、分化、迁移、信号传导变化等多方面。
  • 精确基因编辑:对于精确基因编辑,如插入新基因或编辑基因内特定核苷酸,科学家使用不同的修复机制,称为同源定向修复(HDR)。在HDR中,提供了一个带有期望DNA序列的修复模板,与CRISPR-Cas9组件一起使用。这个模板具有与Cas9切割位点两侧区域同源的序列。当细胞使用HDR途径修复DSB时,它可以将修复模板中的确切序列整合到基因组中。这个过程允许精确基因编辑,因为模板中指定的新基因或核苷酸变化可以准确地插入到DSB位点。然而,HDR的效率比NHEJ低,并且其效率可能因细胞类型和条件而异。因此,实现精确基因编辑需要仔细设计修复模板,并且通常需要广泛筛选编辑过的细胞,以识别发生期望编辑的细胞。
  • 期望DNA序列的修复模板通常以双链DNA (dsDNA) 形式存在,但也可以是单链DNA (ssDNA)。这些模板被设计为包含目标基因编辑位点附近特定序列的同源区域(即与目标基因组中的特定区域具有高度序列同源性)。这些同源区域使得模板能够被细胞的修复机制识别并用于修复CRISPR-Cas9系统引起的DNA双链断裂。具体来说,修复模板的结构通常如下:

    • 双链DNA (dsDNA) 模板:这是一种常见的模板形式,包括目标位点两侧的同源臂(通常各自长几百到几千个碱基),以及中间的改变区域(比如一个新的基因插入位点或者一个点突变)。这种类型的模板用于同源定向修复(HDR),适用于精确插入、删除或替换基因序列。
    • 单链DNA (ssDNA) 模板:相对于dsDNA模板,ssDNA模板通常用于较小的编辑,如单个或少数几个碱基的更改。它们比双链模板更容易渗透细胞,并且在某些情况下可能提供更高的编辑效率。单链模板也包含目标位点附近的同源区域和所需的基因变化。
    • 修复模板可以通过各种方法制备,包括化学合成、聚合酶链反应(PCR)扩增或分子克隆技术。在进行CRISPR-Cas9介导的基因编辑实验时,这些模板与CRISPR-Cas9系统一起引入目标细胞,以指导精确的基因修复过程。

除了siRNA沉默和CRISPR+guideRNA之外,还有其他几种基因编辑技术:

  • Zinc Finger Nucleases(ZFNs):这是一种早期的基因编辑技术,利用锌指蛋白识别特定DNA序列并将其切割,从而引入基因变化。
  • TALENs(Transcription Activator-Like Effector Nucleases):与ZFNs类似,TALENs技术利用定制的蛋白质来识别特定的DNA序列并切割它,引起基因的修改。
  • Prime Editing:这是一种新的基因编辑策略,结合了CRISPR-Cas9系统的定向性和一个逆转录酶,可以在不引入DNA双链断裂的情况下引入精确的基因变化。

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