Comprehensive Genomic and Phenotypic Characterization of a Clinically Susceptible Acinetobacter baumannii Isolate Harboring Extensive Resistance Determinants

摘要

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种机会性病原体，常导致院内感染，并与高死亡率及发病率相关。

本研究对临床分离株HKAB-1（源自一名左心衰竭患者）进行了全面的表型分析，包括抗生素敏感性、生长动力学、生物膜形成及运动能力评估。

基于Illumina NovaSeq平台的全基因组测序及深入生物信息学分析发现，HKAB-1的表型抗生素敏感性与基因型谱存在显著差异：其基因组携带大量编码多药外排泵和毒力因子的基因，却对测试的所有抗生素均敏感，凸显了耐药决定因子调控与表达的复杂性。

这些发现表明，HKAB-1是解析鲍曼不动杆菌耐药性、毒力及其调控通路分子机制的理想模型。

数据规格表

| 主题 | 微生物学：细菌学 | | 具体领域 | 微生物基因组学 | | 数据类型 | 原始及处理后的测序数据、基因组注释、抗生素敏感性谱、生长动力学、生物膜及运动能力数据 | | 数据收集 | 基因组序列：通过Illumina NovaSeq平台对片段化文库进行全基因组测序，经de novo组装。表型分析：使用Tecan Infinite M200 Pro酶标仪（瑞士Tecan）测定吸光度值，直尺测量菌落直径。统计分析：R语言（版本4.3.3）处理数据。 | | 数据来源地 | 中国湖南省衡阳市 | | 数据可及性 | 数据库：GenBank 编号： BioProject：???? SRA：???? GenBank：????

1. Value of the Data 数据价值

   提供临床分离株HKAB-1与标准菌株ATCC19606在生长动力学、抗生素敏感性、运动及生物膜形成能力的定量对比。

   HKAB-1的全基因组测序揭示了丰富的多药外排泵及毒力因子相关基因。

   基因型耐药决定因子与表型敏感性间的矛盾，为研究耐药与毒力基因的调控及功能提供了独特模型。

   数据有助于识别关键致病因子，深化对毒力进化的理解，并评估临床相关鲍曼不动杆菌株的水平基因转移潜力。

2. 背景

鲍曼不动杆菌是院内感染的主要病原体，其基因组可塑性极强，能通过获得外源基因快速适应环境压力。近年来，多重耐药（MDR）、广泛耐药（XDR）甚至全耐药（PDR）菌株的出现加剧了全球医疗负担。外排泵过表达、生物膜形成及表面运动能力是其耐药与持续感染的关键机制。

1. Data Description 数据描述

HKAB-1在MH2B培养基中生长速率显著高于ATCC19606（μmax：0.87 vs. 0.63 h⁻¹）。尽管携带27个耐药基因（包括21个外排泵相关基因）和77个毒力因子，HKAB-1对多数抗生素的敏感性反而更高（如氨基糖苷类、碳青霉烯类MIC降低4-8倍）。基因组分析还发现2个前噬菌体序列及ST392型MLST分型。

1. 实验设计、材料与方法

4.1 样本采集与细菌分离

采集疑似细菌感染的左心衰竭患者的痰液样本进行细菌学分析。样本均匀涂布于血琼脂平板，37℃过夜培养。纯培养物保存于-80℃备用。

4.2 生长曲线测定

将鲍曼不动杆菌菌落接种于Mueller-Hinton II肉汤（MH2B），37℃培养16-18小时。取OD600=0.05的菌液接种至120 ml新鲜MH2B培养基，37℃、150 rpm振荡培养。使用R 4.3.3软件的"nlsMicrobio"包中"baranyi_without_lag"模型拟合OD600读数绘制生长曲线。

4.3 最小抑菌浓度（MIC）测定

参照文献方法[34]，将过夜培养的菌液用新鲜MH2B培养基稀释至OD600=0.02，取30 μl接种至含120 μl系列2倍稀释抗生素的U型底96孔板。37℃、180 rpm振荡培养16小时后，用Tecan Infinite M200 Pro酶标仪测定OD600。MIC定义为OD600值<0.1的最低抗生素浓度。

4.4 生物膜形成实验

改良微孔板法[35]：将OD600=0.05的过夜培养物接种至含1 ml LB培养基的聚苯乙烯管中，30℃或37℃静置培养24小时。弃上清后用蒸馏水洗涤3次，0.1%结晶紫染色20分钟，再洗涤后用无水乙醇溶解，测定OD595。以OD595/OD600比值标准化生物膜形成量。

4.5 运动能力检测

群集运动（swarming）：将OD600=0.1的菌液2 μl点种于0.4%琼脂LB平板，37℃培养24小时。 颤搐运动（twitching）：用2 μl菌液穿刺接种0.8%琼脂LB平板至培养皿-琼脂界面，37℃培养24小时后弃琼脂，0.2%结晶紫染色观察。

4.6 基因组DNA提取与测序

使用Covaris LE220R-plus系统将DNA片段化至350 bp，末端修复加A尾后连接Illumina接头。北京诺禾致源公司采用Illumina平台进行2×150 bp双端测序。原始数据经Trimmomatic v0.39质控后，用SPAdes v3.15.5进行de novo组装（获得73个contig），BV-BRC流程注释。通过OrthoANI计算平均核苷酸一致性（ANI）。

4.7 基因组注释与分析（TODO: 待完善）

使用Abricate比对MEGARes 2.0和ARG-ANNOT数据库分析耐药基因；VFDB和PHASTEST分别预测毒力因子和前噬菌体；Proksee绘制基因组图谱；PubMLST进行多位点序列分型（MLST）。

（注：本节需根据实际分析结果补充具体参数和图表）

DATA AVAILABILITY 数据可用性

HKAB-1原始测序数据已提交至NCBI GenBank（编号xxxx）。

表1：鲍曼不动杆菌临床分离株HKAB-1与标准菌株ATCC19606的抗生素敏感性（MIC，μg/ml） 抗生素类别 抗生素 ATCC 19606 HKAB-1 氨基糖苷类 阿米卡星 16 4 庆大霉素 16-32 1-2 妥布霉素 2-4 0.5 碳青霉烯类 多尼培南 0.5 0.125 美罗培南 1 0.125 头孢菌素类 头孢噻肟 8 8-16 头孢曲松 64-128 32-64 头孢呋辛 128 32-64 氟喹诺酮类 环丙沙星 1 0.125 左氧氟沙星 0.5 0.125-0.25 大环内酯类 阿奇霉素 32-64 4 克拉霉素 64-128 32-128 红霉素 16 8 青霉素类 阿莫西林 256 16 苯唑西林 256-512 256 哌拉西林 128 32 四环素类 多西环素 2 0.25 米诺环素 0.5 0.125 四环素 32-64 4 替加环素 4 0.125-0.25 其他抗生素 氯霉素 64-128 64-128 克林霉素 256 256-512 夫西地酸 256 256 利奈唑胺 256 256 呋喃妥因 128-256 >256 磷霉素 >1024 >1024 多粘菌素B 0.25 0.5 利福平 2 4 磺胺甲恶唑 1024 1024 甲氧苄啶 64-128 32-128 万古霉素 256-512 256

表2：基因组测序数据及特征概述

指标 数值 总测序读长数
覆盖度 Contig数量
粗一致性（%） 细一致性（%） 完整性（%）
污染度（%）
基因组大小（bp）
Contigs N50（bp） Contigs L50 GC含量（%） 基因总数
编码序列（CDS）数量 tRNA数量
rRNA数量

表3：基于Pasteur分型方案的HKAB-1 MLST分型（ST392） 基因座 等位基因 Contig 起始位置 终止位置 cpn60 1 1 820321 820725 fusA 65 8 160365 160997 gltA 6 7 238432 238914 pyrG 2 1 53190 53486 recA 63 1 126818 127189 rplB 1 2 410799 411128 rpoB 4 5 5765 6220

表4：HKAB-1的预测抗生素耐药基因 （内容待补充）

表5：基于VFDB的HKAB-1毒力因子预测 （内容待补充）

图1：ATCC19606与HKAB-1的生长动力学及生物膜形成

（A） 采用Baranyi生长模型（无滞后期）拟合的生长曲线，阴影区表示95%置信区间。

（B） 模型计算的最大比生长速率（μmax）。

（C） 5小时时间点的OD₆₀₀值。

（D） 30°C和37°C下结晶紫染色的生物膜定量分析（数据为三次独立实验均值±SEM，统计学采用非配对t检验）。

图2：ATCC19606与HKAB-1的运动表型

（A-B） 琼脂-塑料界面穿刺接种测定颤搐运动（twitching），结晶紫染色后测量直径。

（C-D） 半固体琼脂表面

图3 (TODO: check correction?)

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