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Tags: research
意见 1: 应对 HKAB-1 与基因组数据库中其他代表性 Acinetobacter baumannii 菌株进行比较基因组分析，以展示它们的进化关系。
回应 1: 感谢审稿人的宝贵建议。为此，我们进行了基于核心基因组的系统发育分析，将 HKAB-1 放置在 Acinetobacter 属的更广泛进化背景中。如图 3B 所示，HKAB-1 聚类于 A. baumannii 分支内，与已知临床菌株（如 ATCC19606、AYE 和 AB030）共享近期共同祖先。系统发育树还显示 A. baumannii 与其他 Acinetobacter 种（包括 A. pittii、A. junii 和 A. tandoii）明显分离，从而支持了 HKAB-1 的物种身份及其进化定位。图示及系统发育方法和结果的详细描述已纳入修订稿。
手稿修订位置（材料与方法）:
“利用注释后的基因组组装文件（GFF3 格式）构建 HKAB-1 与代表性 Acinetobacter 菌株的核心基因组系统发育树。核心基因识别使用 Roary v3.13.0 [Page 2015]，多序列比对采用 MAFFT v7.526 [Katoh 2013]，系统发育推断使用 RAxML-NG v1.2.2 [Kozlov 2019] 在 GTR+G 模型下进行 1000 次自举分析。”
手稿修订位置（结果）:
“进一步通过核心基因组分析结合公开可用的 Acinetobacter 基因组验证物种身份和系统发育关系。结果显示，HKAB-1 聚类于 A. baumannii 分支，与临床相关菌株 AB030 进化关系密切（图 3B）。”
图示:
“图 3B：HKAB-1 与代表性 Acinetobacter 菌株的核心基因组系统发育树。HKAB-1 聚类于 A. baumannii 分支，并与非 baumannii 种（如 A. pittii、A. junii 和 A. tandoii）明显分离。”
参考文献:
意见 2: 如表 1 所示，HKAB-1 对头孢菌素、青霉素及其他一些抗生素表现出耐药性，将其定义为“药物敏感 Acinetobacter baumannii”是否合适？
回应 2: 感谢审稿人的提醒。然而，与 A. baumannii ATCC19606 相比，HKAB-1 对头孢菌素、青霉素及其他若干抗生素表现出更高的敏感性。具体 MIC 值如下：
头孢菌素：cefotaxime（8–16 μg/ml vs. 16 μg/ml）、ceftriaxone（32–64 μg/ml vs. 64–128 μg/ml）、cefuroxime（32–64 μg/ml vs. 128 μg/ml）； 青霉素：amoxicillin（16 μg/ml vs. 256 μg/ml）、piperacillin（8–16 μg/ml vs. 32–64 μg/ml）。
此外，HKAB-1 仅对两种抗生素（利福平和氧氯青霉素）表现耐药，而 ATCC19606 对更多药物表现耐药。因此，我们仍认为 HKAB-1 是药物敏感菌株。
意见 3: 图 1 中，HKAB-1 生长速率高于标准菌株。可能机制是什么？应详细讨论。
回应 3: 感谢建议。为解释 HKAB-1 生长速率较快的原因，我们比较了 HKAB-1 与 ATCC19606 的功能基因组。重点分析代谢、营养物质摄取及细胞壁生物合成相关的 COG 功能类别（见图 S2），发现 HKAB-1 在这些关键类别中基因数量更多。此外，HKAB-1 的 adeB 表达显著下调（图 4A，ΔΔCT = -7.27 ± 0.21；折叠变化 = 0.0065），虽然 adeB 过表达未直接影响生长，但其下调可能减轻了与外排泵活性相关的能量负担。因此，我们推测 HKAB-1 的代谢潜力扩展和能量消耗型耐药机制下调共同促成了其加速生长。图示和详细分析已纳入修订稿。
手稿修订位置（结果）:
“…尽管对所有测试抗生素高度敏感（图 1E、2E），HKAB-1 表现出更高的代谢能力，表现在 MH2B 和血清培养基中生长速率和生物量（OD600）更高（图 1A、1D）。COG 功能类别分析显示，HKAB-1 在能量产生与转换（C）、氨基酸代谢（E）、无机离子转运（P）、细胞壁生物合成（M）、碳水化合物代谢（G）等功能类别中基因更多（图 S2），提示其营养摄取、代谢通路和膜合成能力增强，减少生理瓶颈，提高生长效率。尤其是 adeB 外排泵显著下调，可能缓解代谢负担，促进生长。”
参考文献:
评论 4： 应该分析 HKAB-1 中与生物膜形成和群体运动相关的基因簇，并讨论其功能。
回复 4： 感谢审稿人的宝贵建议。我们同意审稿人观点，HKAB-1 中与生物膜形成和运动相关的基因簇值得进行详细分析。为此，我们使用 RT-qPCR 评估了 HKAB-1 中生物膜和运动相关基因的转录调控情况。与 ATCC19606 相比，HKAB-1 中 bap 和 T4P 基因（如编码假定菌毛的 pilA 和编码 IV 型菌毛生物合成蛋白的 pilO）显著上调（见图 4B）。此外，我们还比较了生物膜相关细胞与浮游培养物中的基因表达，观察到 bap、聚 N-乙酰葡萄糖胺 (PNAG) 合成基因以及 T4P 基因在生物膜条件下显著诱导。值得注意的是，RND 外排泵基因 adeB 和 adeG 在生物膜中也强烈诱导（图 4C）。总体而言，这些结果表明 HKAB-1 中增强的生物膜形成和运动表型可能由 bap、RND、PNAG 和 T4P 相关基因的协调上调 驱动。
我们还研究了编码 IV 型菌毛（T4P）的基因，T4P 在 A. baumannii 的生物膜发育和轻拍运动中发挥关键作用（Eijkelkamp 等, 2011；Ronish 等, 2019）。其中，编码主要菌毛亚单位的 pilA 与运动和生物膜表型调控相关（Ronish 等, 2019）。我们对 HKAB-1 的 PilA 与已知株 AB5075、BIDMC57、ACICU 和 ATCC19606 进行了序列比对，结果显示 HKAB-1 PilA 与参考株不同，提示其在调控 HKAB-1 运动和生物膜形成中可能具有菌株特异性功能。
此外，我们发现 ATCC19606 缺失 pilN 基因，该基因对 PilMNOP 内膜排列亚复合体中 PilNO 异二聚体的正确组装至关重要。pilN 的缺失可能削弱 IV 型菌毛生物合成及其相关运动功能（Leighton 等, 2015），这可能解释了 ATCC19606 生物膜形成和运动表型较弱的现象。
上述结果及详细描述已纳入修订后的手稿中。
结果：
手稿清稿第 xx 页，第 xx 行：
鉴于生物膜相关蛋白 Bap、Csu 菌毛、PNAG 合成和 T4P 在生物膜形成和轻拍运动中的作用（表 S2）[50 Loehfelm 2008, 51 Tomaras 2003, 52 Choi 2009, 53 Ronish 2019]，我们检测了 HKAB-1 中相关基因的转录水平。ATCC19606 除 csuC 外表达较低（bap: ∆CT = -4.95 ± 0.32；csuC: ∆CT = -1.22 ± 0.32；pgaB: ∆CT = -7.58 ± 0.32；pilA: ∆CT = -10.04 ± 0.32；pilO: ∆CT = -8.17 ± 0.32）（图 4B）。csuC 和 pgaB 在两株之间无明显转录差异，但 HKAB-1 中 bap 和 T4P 特异基因 显著上调（bap: ΔΔCT = 3.03 ± 0.45；倍数变化 = 8.14；pilA: ΔΔCT = 5.54 ± 0.45；倍数变化 = 46.54；pilO: ΔΔCT = 2.42 ± 0.45；倍数变化 = 5.34）（图 4B），与其强生物膜形成和运动表型一致。
进一步比较生物膜相关细胞与浮游培养物中的基因表达。csuC 在两种条件下无明显差异（图 4C），而 pgaB 在浮游细胞低表达，但在生物膜中显著诱导（ΔΔCT = 5.55 ± 0.43；倍数变化 = 46.79），表明 PNAG 合成在生物膜形成中的关键作用（图 4C）。bap 和 T4P 特异基因（pilA 和 pilO）在生物膜相关细胞中进一步上调（bap: ΔΔCT = 2.06 ± 0.43；倍数变化 = 4.17；pilA: ΔΔCT = 2.73 ± 0.43；倍数变化 = 6.62；pilO: ΔΔCT = 3.77 ± 0.43；倍数变化 = 13.60）（图 4B、4C）。RND 外排泵基因 adeB 和 adeG 在浮游细胞中低表达，但在生物膜中显著上调（adeB: ΔΔCT = 7.88 ± 0.43；倍数变化 = 236.19；adeG: ΔΔCT = 7.54 ± 0.43；倍数变化 = 185.98），而 adeJ 无变化（图 4C）。此外，与生物膜形成相关的铁载体基因 basA（acinetobactin）和 bfnL（fimsbactin）也在生物膜中显著诱导（图 4C），提示其在生物膜发育中的作用。
综合来看，HKAB-1 中 bap 和 T4P 基因上调，以及在生物膜条件下进一步诱导，同时伴随 PNAG、RND 外排泵和铁载体系统的激活，提示这些因子共同驱动 HKAB-1 的强生物膜表型。
见图 4B、4C 获取更多信息。
讨论：
手稿清稿第 xx 页，第 xx 行：
“T4P 是 A. baumannii 的关键毒力因子，介导宿主细胞粘附、生物膜形成和轻拍运动（53 Ronish 2019）。PilN 和 PilO 是 PilMNOP 内膜排列亚复合体的高度保守组分，PilNO 异二聚体的正确形成对 T4P 生物合成至关重要（64 Leighton 2015）。比较基因组分析显示 ATCC19606 中 pilN 基因破损（表 S3），可能导致菌毛组装受损，从而影响其运动和生物膜形成。相比之下，HKAB-1 的所有 T4P 基因（包括 pilN）均完整（表 S3），与其保持轻拍运动和强生物膜表型一致。先前研究表明，编码主要菌毛亚单位的 pilA 变异可影响菌毛表面电性并调节相关功能（44 Eijkelkamp 2011, 53 Ronish 2019）。19 株 A. baumannii PilA 序列的系统发育分析显示，HKAB-1 PilA 形成独特分支，与 ACICU、NIPH-329、Ab44444 和 OIFC137 更接近，而与 AB5075、BIDMC57 或 ATCC19606 差异较大（图 S3A）。值得注意的是，尽管与 ACICU 聚类，HKAB-1 PilA 缺少末端丝氨酸残基，属于非糖基化亚组（图 S3）。这些结果提示 HKAB-1 PilA 在调控运动和生物膜形成中可能具有菌株特异性作用。此外，HKAB-1 中 pilA 和 pilO 表达升高，支持其增强的轻拍运动和生物膜表型（图 1E、2、4C）。”
见图 S3 获取更多信息。
手稿清稿第 xx 页，第 xx 行：
“此外，HKAB-1 编码生物膜相关蛋白 bap，这对 A. baumannii 的生物膜发育至关重要 [50 Loehfelm 2008]，ATCC19606 也存在该基因。HKAB-1 中 bap 和 T4P 基因（如 pilA 和 pilO）表达显著升高，并在生物膜条件下进一步诱导，同时伴随 PNAG 合成上调（图 4B、4C），可能是其增强生物膜形成能力的分子基础。有趣的是，AdeB 和 AdeG RND 外排泵在浮游培养中低表达，但在生物膜条件下高度响应，提示其在生物膜成熟或维持中的作用（67 Richmond 2016）。由 Bap 和 RND 外排系统介导的生物膜形成是 A. baumannii 在宿主及环境中持续存活的重要毒力机制 [41 Lee 2008, 68 He 2015, 67 Richmond 2016]。”
评论 5： 应通过溶血实验、蛋白酶实验，甚至小鼠模型评估 HKAB-1 的毒力。
回复 5： 感谢非常好的建议。我们已完成附加实验并纳入修订稿，结果显示 HKAB-1 不具有溶血和蛋白酶活性。然而，30 天修订期限内无法进行小鼠体内毒力实验。
手稿清稿第 xx 页，第 xx 行：
溶血和蛋白酶实验 溶血实验在补充 5% 脱纤马血的 Columbia 血琼脂平板上进行（24 Tuttobene 2021）。简言之，将 OD600 调至 2.5 的过夜培养物 10 μL 接种于血琼脂平板，在 37°C 培养 48 小时。蛋白酶实验在脱脂奶琼脂平板上进行，于 37°C 培养 24 小时。
手稿清稿第 xx 页，第 xx 行：
“从患者痰液中分离出 HKAB-1 菌株，并在补充 5% 脱纤马血的 Columbia 血琼脂平板上培养。血琼脂平板上未观察到溶血或蛋白酶活性（图 S1）。”
评论 1：引言部分缺乏对研究假设的明确陈述。尽管摘要中简要概述了假设，并在讨论部分进行了讨论，但引言中未明确或正式提出。建议在引言末尾添加一句，如“本研究旨在……”以明确定义研究目标。
回应 1：感谢审稿人提出的深刻建议。我们同意在引言部分应明确陈述研究假设。 我们在修订稿中加入了以下段落： 修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “在本研究中，我们表征了一株临床分离的鲍曼不动杆菌（A. baumannii）菌株 HKAB-1，该菌株显示出加速的生长动力学和显著的毒力相关表型，如增强的生物膜形成、运动性、干燥耐受性和血清抗性，尽管其对多种抗生素广泛敏感。全基因组测序表明 HKAB-1 属于序列类型 ST392，并揭示了多种潜在毒力因子的存在，包括 hemO 基因簇和血红素利用簇 1。比较基因组分析显示，涉及营养运输、代谢途径和膜生物合成的基因差异可能导致 HKAB-1 的生长增强。值得注意的是，HKAB-1 中 adeB 的表达显著受抑，这可能解释了其尽管携带多种抗性决定因素仍表现为药物敏感的表型。此外，在生物膜条件下，编码生物膜相关蛋白 Bap、聚-N-乙酰葡糖胺（PNAG）生物合成基因和 T4P 组分的基因被高度诱导，支持它们在 HKAB-1 强大生物膜表型中的作用。这些发现表明抗生素抗性和毒力之间可能存在进化权衡，强调需要重新评估抗生素敏感的鲍曼不动杆菌在感染控制和抗性监测中的临床意义。需要进一步研究以阐明这种表型平衡的分子机制。”
评论 2：抗生素抗性和毒力之间可能存在权衡的假设非常有趣且相关。然而，这一结论应更谨慎地表述，因为稿件未提供直接的分子证据支持该假设。尽管表型实验（如增强的生物膜形成、运动性和干燥耐受性）得到了充分记录，基因组分析也揭示了抗性和毒力基因的存在，但研究未包括基因表达或调控机制的功能验证（如 RNA 表达分析或蛋白质组学）。因此，我建议修改相关陈述，反映这种权衡是一种假设或观察，而不是已确认的机制联系。例如，可以写：“我们的发现提示可能存在权衡……”或“观察到的表型可能表明……”，并承认需要进一步研究以探索这种关系的分子基础。
回应 2：感谢审稿人的深刻评论。我们同意当前结果不足以确凿支持抗生素抗性和毒力之间可能存在权衡的假设。为加强研究，我们进行了额外实验以进一步评估 HKAB-1 的基因型特征与表型特征之间的关系（参见对评论 3 的回应）。尽管如此，我们已修订讨论部分，以更谨慎地解释我们的发现，并强调需要进一步研究。
简要总结： 修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “这些发现反映了某些鲍曼不动杆菌菌株可能存在的进化权衡，倾向于毒力相关特征而非抗菌抗性机制的表达。这一结果强调需要持续进行基因组监测，以监测像 HKAB-1 这样具有高毒力但药物敏感的菌株的出现，这些菌株可能在选择压力下成为抗性发展的储备库。” 摘要： 修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “这些发现提示抗生素抗性和毒力之间可能存在权衡，强调监测抗生素敏感但高毒力的鲍曼不动杆菌分离株的重要性，这些菌株可能作为抗性进化的潜在储备库。需要进一步研究以阐明这种表型平衡的机制。” 引言： 修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “这些发现提示抗生素抗性和毒力之间可能存在进化权衡，强调需要重新评估抗生素敏感的鲍曼不动杆菌在感染控制和抗性监测中的临床意义。需要进一步研究以阐明这种表型平衡的分子机制。” 讨论： 修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “总的来说，这些发现可能支持一种模型，即抗菌抗性的降低被增强的毒力特性和环境适应性所抵消。这种权衡的分子机制尚不清楚，需要进一步研究。”
评论 3：基因型并不总是直接转化为表型。整篇稿件中，某些基因（如 adeB）的存在常被解释为活跃抗性或毒力机制的证据。然而，若无功能验证，如基因表达或蛋白活性实验，这种解释可能过于夸大。我建议采用更细致的措辞，例如使用“潜在活性”或“推测功能性”等术语，以反映仅基因存在并不确认其功能表达或对表型的贡献。
回应 3：感谢审稿人提出的非常好的建议。我们同意基因型并不总是直接转化为表型。为解决这一问题，我们进行了额外实验以验证 HKAB-1 的基因型特征与表型特征之间的关系。RT-qPCR 分析显示，HKAB-1 和 ATCC19606 之间 adeG 和 adeJ 的表达无显著差异，而 HKAB-1 和 ATCC19606 中 adeB 的表达显著下调（参见图 4A），提示 AdeB 外排泵的差异表达（鲍曼不动杆菌抗生素抗性的主要贡献者）可能解释了 HKAB-1 增加的敏感性。虽然本研究未评估其他抗性决定因素（如 β-内酰胺酶或 MFS、MATE、SMR、ABC 或 PACE 的外排系统），但我们的发现表明 AdeB 是 HKAB-1 增加敏感性的主要因素。 IV 型菌毛（T4P）是鲍曼不动杆菌的重要毒力因子，涉及宿主细胞粘附、生物膜形成和抽搐运动性（Ronish 2019）。为研究菌株间 T4P 相关基因表达的潜在差异，我们比较了 HKAB-1 和 ATCC19606。差异表达分析显示，HKAB-1 相对于 ATCC19606 中与生物膜形成和抽搐运动性相关的基因 bap、pilA 和 pilO 显著上调（参见图 4B），这可能导致其增强的生物膜形成和抽搐运动性。此外，ATCC19606 中缺乏功能性 pilN 基因可能破坏 IV 型菌毛的组装，导致其运动性和生物膜形成能力受损。相比之下，HKAB-1 中所有 IV 型菌毛（T4P）基因，包括 pilN，均完整（参见表 S3），与其观察到的抽搐运动性和强大生物膜表型一致。此外，我们还比较了生物膜相关细胞和浮游培养物之间的基因表达，观察到在生物膜条件下，bap、聚-N-乙酰葡糖胺（PNAG）生物合成基因和 T4P 基因显著诱导。值得注意的是，adeB 和 adeG RND 外排泵基因在生物膜中也强烈诱导（图 4C）。总的来说，这些结果表明，增强的生物膜形成和运动性表型可能由 bap、RND、PNAG 和 T4P 相关基因的协同上调驱动。 相反，与毒力相关的铁获取系统（包括血红素利用和铁载体生物合成途径）的基因表达分析显示，这些系统在血清暴露下的转录诱导增加（参见图 4D）。这一观察表明，这些系统在 HKAB-1 在铁限制、模拟宿主环境的血清中存活的能力中起关键作用。值得注意的是，虽然 ATCC19606 具有铁载体生物合成基因，但缺乏 HKAB-1 中存在的 hemO 簇和血红素利用簇 1。鉴于血清富含血红素结合铁但几乎不含游离铁（Parrow 2013），这种基因缺陷可能解释了 ATCC19606 相对于 HKAB-1 在血清中的存活能力降低。 这些在 HKAB-1 中观察到的增强表型特征可能与毒力相关基因的上调表达相关。为支持这一观点，我们进行了以下实验并将其纳入稿件：
材料与方法： 修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行：
RNA 提取
为评估毒力相关和 RND 外排泵基因的表达，鲍曼不动杆菌菌株过夜培养物被稀释至初始 OD600 为 0.05，置于 25 mL LB 培养基中，于 37°C、180 rpm 振荡培养至 OD600 达 0.5–0.7。取 500 μL 培养物，使用 RNAstore Reagent（天根生物，中国）稳定。为评估与血清耐受性相关的基因表达，在含血清培养基和 MH2B（作为对照）中生长的鲍曼不动杆菌细胞于 OD600 达 0.5–0.7 时收获。每种培养物取 500 μL，使用 RNAstore Reagent 稳定。总 RNA 使用 RNAprep Pure Bacteria Kit（天根生物，中国）提取。为测定生物膜相关基因的表达，生物膜使用 RNAprotect Bacteria Reagent（Qiagen，德国）重悬浮。RNA 提取使用 RNeasy Mini Kit（Qiagen，德国）进行。RNA 浓度和纯度使用 Nanodrop 分光光度计测定。
反转录 qPCR
反转录使用 FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix II（天根生物，中国）进行，以 500 ng 总 RNA 为模板。所得 cDNA 的浓度和纯度使用 Nanodrop 分光光度计评估。定量 PCR（qPCR）在 Applied Biosystems StepOne 热循环仪上使用 2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（AbClonal Technology，美国）进行，每反应使用 400 ng 总 cDNA。引物序列列于表 S1，以 rpoB 作为参考基因。基因表达分析按之前描述的方法进行 [25 Foong 2025]。ΔCT 值计算为 CT(rpoB) – CT(目标基因)。处理组与对照组之间的平均 ΔCT 值差异使用 R 4.4.1 版 [19 R Core Team 2021] 实现的方差分析（ANOVA）模型进行分析，包含基因和基因:处理交互项。Tukey 的诚实显著差异（HSD）检验用于确定组间基因表达的统计显著差异。
结果： 修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行：
“外排泵和毒力相关基因的相对表达
为研究外排泵和毒力相关基因在抗生素抗性和致病性中的功能相关性，我们在相关表型条件下使用 RT-qPCR 量化了这些基因的表达水平。在 LB 培养基中，HKAB-1（adeG: ∆CT = -9.45 ± 0.15; adeJ: ∆CT = -1.97 ± 0.15）和 ATCC19606（adeG: ∆CT = -9.42 ± 0.15; adeJ: ∆CT = -1.49 ± 0.15）之间 adeG 和 adeJ 的转录无显著差异（图 4A）。相反，HKAB-1 中 adeB 显著下调（ΔΔCT = -7.27 ± 0.21; 折叠变化 = 0.0065），这可能导致其尽管携带多种抗性基因仍表现为抗生素敏感表型。 鉴于生物膜相关蛋白 Bap、Csu 菌毛、聚-N-乙酰葡糖胺（PNAG）生物合成和 IV 型菌毛（T4P）在生物膜形成和抽搐运动性中的作用（表 S2）[50 Loehfelm 2008, 51 Tomaras 2003, 52 Choi 2009, 53 Ronish 2019]，我们检查了 HKAB-1 中这些基因的转录特征。ATCC19606 除 csuC 外，表现出相对较低的表达（bap: ∆CT = -4.95 ± 0.32; csuC: ∆CT = -1.22 ± 0.32; pgaB: ∆CT = -7.58 ± 0.32; pilA: ∆CT = -10.04 ± 0.32; pilO: ∆CT = -8.17 ± 0.32）（图 4B）。编码 Csu 菌毛组装伴侣蛋白的 csuC 和编码 PNAG 生物合成脱乙酰酶的 pgaB 在两株菌之间无显著转录差异。然而，HKAB-1 中 bap 和 T4P 特异性基因（包括编码假定菌毛蛋白的 pilA 和编码 T4P 生物合成蛋白的 pilO）显著上调（bap: ΔΔCT = 3.03 ± 0.45; 折叠变化 = 8.14; pilA: ΔΔCT = 5.54 ± 0.45; 折叠变化 = 46.54; pilO: ΔΔCT = 2.42 ± 0.45; 折叠变化 = 5.34）（图 4B），与其强大的生物膜和运动性表型一致。 为进一步评估生物膜相关基因在生物膜发育中的功能作用，我们比较了生物膜相关细胞和浮游培养物之间的表达。一致于我们早先的结果（图 4B），csuC 在两种条件下无显著转录差异（图 4C）。出乎意料的是，在浮游细胞中表达水平较低的 pgaB 在生物膜细胞中强烈诱导（ΔΔCT = 5.55 ± 0.43; 折叠变化 = 46.79），支持 PNAG 生物合成在生物膜形成中的关键作用（图 4C）。正如预期，bap 和 T4P 特异性基因（pilA 和 pilO）在生物膜相关细胞中相对于浮游细胞进一步上调（bap: ΔΔCT = 2.06 ± 0.43; 折叠变化 = 4.17; pilA: ΔΔCT = 2.73 ± 0.43; 折叠变化 = 6.62; pilO: ΔΔCT = 3.77 ± 0.43; 折叠变化 = 13.60）（图 4B, 4C）。有趣的是，在浮游 HKAB-1 中表达水平较低的 RND 外排泵基因 adeB 和 adeG 在生物膜相关细胞中显著诱导（adeB: ΔΔCT = 7.88 ± 0.43; 折叠变化 = 236.19; adeG: ΔΔCT = 7.54 ± 0.43; 折叠变化 = 185.98），而 adeJ 表达未变（图 4C）。鉴于先前报道将铁载体生物合成与生物膜发育联系起来（54 Wang, 2025），我们还检查了铁载体相关基因，发现 basA（acinetobactin 簇）和 bfnL（fimsbactin 簇）在生物膜细胞中强烈诱导（图 4C），表明其在生物膜发育中的贡献作用。总的来说，HKAB-1 相对于 ATCC19606 中 bap 和 T4P 基因的显著上调，结合其在生物膜条件下的进一步诱导以及 PNAG、RND 外排泵和铁载体系统的同步激活，提示了一个驱动 HKAB-1 强大生物膜表型的协同因子网络。 血红素利用簇在血清条件下对细菌存活至关重要 [54 de Léséleuc 2014]。鉴于 HKAB-1 携带血红素利用基因，而 ATCC19606 缺乏这些基因，我们通过分析涉及血红素摄取和铁载体生物合成的基因表达，评估了铁获取系统对血清暴露的调控反应。在 MH2B 标准生长条件下，血红素获取基因（包括编码假定血红素氧化酶的 hemO 和血红素利用簇 1 中预测的 TonB 依赖性受体的 ACP71R_07005）以及铁载体生物合成基因（如 basA（acinetobactin 簇）和 bfnL（fimsbactin 簇））的表达相对较低（图 4D）。在血清暴露下，所有四个基因显著激活（hemO: ∆∆CT = 9.13 ± 0.42; 折叠变化 = 558.50; ACP71R_07005: ∆∆CT = 1.89 ± 0.42; 折叠变化 = 3.71; bfnL: ∆∆CT = 6.05 ± 0.42; 折叠变化 = 66.29; basA: ∆∆CT = 4.32 ± 0.42; 折叠变化 = 19.96）（图 4D），提示铁获取途径在模拟宿主条件下强烈诱导。”
讨论：
修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “HKAB-1 的高抗生素敏感表型……与此观察一致，HKAB-1 的基因组分析显示存在多种抗生素抗性基因，包括编码临床上重要的 RND 外排泵的基因，这些是鲍曼不动杆菌中多重耐药表型的关键贡献者 [55 Nowak 2015]。有趣的是，HKAB-1 中 adeB 的转录水平较低（∆CT = -10.11 ± 0.15），相比之下，ATCC19606 为（∆CT = -2.85 ± 0.15），HKAB-1 和 ATCC19606 之间的比较基因分析显示 HKAB-1 中 adeB 下调（ΔΔCT = -7.27 ± 0.21; 折叠变化 = 0.0065）。相比之下，在标准生长培养基中，adeG 和 adeJ 的表达水平无显著差异。这些发现提示，adeB 表达的减少可能是 HKAB-1 增加敏感性的原因，因为该外排泵在临床鲍曼不动杆菌分离株的多重耐药性中至关重要（8 Rumbo 2013, 58 Marchand 2004）。此外，其他抗性机制（如 β-内酰胺酶或非 RND 外排系统）的活性降低或下调也可能导致观察到的抗生素敏感表型。总的来说，这些发现表明，尽管 HKAB-1 目前保持抗生素敏感，但其具有在适当选择压力下表达和激活抗性特征的遗传潜力，需要在临床环境中对这类菌株进行仔细监测。” 修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “进一步的基因组分析显示，HKAB-1 携带 hemO 基因簇……与这些发现一致，我们观察到血清暴露下 hemO 和 ACP71R_07005（分别编码血红素氧化酶和假定的 TonB 依赖性受体）显著上调。此外，在这些条件下，涉及铁载体 acinetobactin（basA）和 fimsbactin（bfnL）生物合成的基因也显著上调。这些结果表明，血红素利用和铁载体介导的铁获取对血清中的细菌适应性至关重要。我们认为，hemO 簇、血红素利用簇 1 和多种铁载体系统的共同存在有助于 HKAB-1 在血清中的优越存活，血清中游离铁有限但富含血红素结合铁 [62 Parrow 2013]。虽然已显示 ATCC19606 能利用血红素，但早期研究使用了高于血清中发现的血红素浓度 [63 Zimbler 2009]，这可能解释了其在这些条件下的生长减少。”
修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “T4P 是鲍曼不动杆菌的关键毒力因子，介导宿主细胞粘附、生物膜形成和抽搐运动性（53 Ronish 2019）。PilN 和 PilO 是 PilMNOP 内膜对齐亚复合体的保守组分，PilNO 的适当异二聚化对 T4P 生物合成至关重要（64 Leighton 2015）。比较基因组分析显示，ATCC19606 菌株携带一个受损的 pilN 基因（表 S3）。缺乏功能性 pilN 可能损害菌毛组装，导致其运动性和生物膜形成的缺陷。相比之下，HKAB-1 中所有 T4P 基因，包括 pilN，均完整（表 S3），与其保留的抽搐运动性和强大生物膜表型一致。此外，先前研究表明，编码主要菌毛亚单位的 pilA 的变异可影响菌毛表面静电特性，并调节鲍曼不动杆菌中菌毛相关功能（44 Eijkelkamp 2011, 53 Ronish 2019）。Acinetobacter 中的 PilA 变体分为糖基化形式（具有 C 端丝氨酸残基作为糖基化位点）和非糖基化形式（缺乏该残基）（图 S3B）。PilA 的糖基化由 T4P 特异性 O-寡糖基转移酶 tfpO 介导，位于 pilA 下游（65 Harding 2015）。虽然 PilA 糖基化的功能影响尚不确定，但菌株特异性变体与不同表型相关（66 Piepenbrink 2016）。例如，AB5075 变体与抽搐运动性相关，而 ACICU 变体促进生物膜形成（53 Ronish 2019）。19 株鲍曼不动杆菌菌株的 PilA 序列系统发育分析显示，HKAB-1 PilA 形成一个独特的分支，与 ACICU、NIPH-329、Ab44444 和 OIFC137 的变体更接近，而与 AB5075、BIDMC57 或 ATCC19606 分离（图 S3A）。值得注意的是，尽管与 ACICU 分支，HKAB-1 PilA 缺乏末端丝氨酸残基，属于非糖基化亚组（图 S3）。这些发现提示 HKAB-1 PilA 在调节运动性和生物膜形成中可能具有菌株特异性作用。此外，HKAB-1 中 pilA 和 pilO 的高表达支持该菌株观察到的增强抽搐运动性和生物膜表型（图 1E, 2, 4C）。”
修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “此外，HKAB-1 编码 bap，一个对鲍曼不动杆菌生物膜发育至关重要的生物膜相关蛋白 [50 Loehfelm 2008]，该蛋白也在 ATCC19606 中存在。HKAB-1 中 bap 和 T4P 基因（如 pilA 和 pilO）的显著高表达，结合其在生物膜条件下的进一步诱导以及 PNAG 生物合成的上调（图 4B, 4C），可能是其增强生物膜形成能力的分子基础。有趣的是，在浮游培养物中表达水平较低的 AdeB 和 AdeG RND 外排泵在生物膜条件下高度响应，提示其在生物膜成熟或维持中的作用（67 Richmond 2016）。生物膜形成，部分由 Bap 和 RND 外排系统介导，是鲍曼不动杆菌在恶劣宿主和环境条件下持续存在的重要毒力机制 [41 Lee 2008, 68 He 2015, 67 Richmond 2016]……”
结论性评论 (Concluding remarks)：
修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “尽管鲍曼不动杆菌 HKAB-1 携带多种抗菌抗性基因，包括临床上相关的假定 β-内酰胺酶以及多种 RND 和 MFS 外排泵，但该菌株对所有测试抗生素保持敏感……具体来说，HKAB-1 携带血红素利用簇和多种生物膜相关基因，使其在血清中的存活能力和生物膜形成能力相较于 ATCC19606 增强。”
参考文献
Ronish 等. The structure of PilA from Acinetobacter baumannii AB5075 suggests a mechanism for functional specialization in Acinetobacter type IV pili. J. Biol. Chem. 2019 294, 218–230.
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He 等. Biofilm formation caused by clinical Acinetobacter baumannii isolates is associated with overexpression of the AdeFGH efflux pump. Antimicrob. Agents Chemother. 2015 59, 4817–4825.
评论 4：稿件的主要局限之一是完全缺乏关于患者的临床数据，除提到左侧心力衰竭外。这削弱了感染的临床背景，降低了研究发现的转化价值。尽管研究是回顾性的，但如果作者能纳入即使是简短的关于感染过程、住院时间、临床管理和治疗结果的信息，将大大增强工作的相关性和影响力。如果这些数据可用，我强烈建议作者将其纳入当前稿件。
回应 4：感谢审稿人的深刻建议。我们在修订稿中加入了以下段落：
修订稿干净版本，第 xx 页，第 xx 行： “一名患有左侧心力衰竭并伴有细菌性呼吸道感染临床症状的患者入院。从患者痰液中分离出细菌分离株，命名为 HKAB-1，在补充 5% 去纤维蛋白马血的哥伦比亚血琼脂平板上培养后获得。琼脂平板上未观察到溶血活性（图 S1）。根据初步表型特征，该分离株被初步鉴定为鲍曼不动杆菌。患者具有多种高危因素，包括高龄、严重心功能障碍和多器官功能障碍。根据医院治疗方案，启动了为期七天的哌拉西林-他唑巴坦作为经验性抗菌治疗。完成抗生素疗程后，患者的呼吸道症状显著改善。住院第九天，心脏检查显示心音正常，所有瓣膜区域无病理性杂音，肺部听诊发现双肺少量干啰音。鉴于临床改善，患者被认为适合出院。”
评论 5：研究缺乏 RNA-seq 或 RT-qPCR 数据，这本可以支持关于毒力和抗性基因（如 ade、bap、hemO）表达的结论。包含此类功能数据将加强基因型与表型之间的联系。我建议在讨论部分添加简短评论，说明这一局限性。
回应 5：我们感谢审稿人的宝贵建议。如对评论 3 的回应中所述，我们已进行 RT-qPCR 实验以研究基因型与表型之间的关系。
高毒力 指 什么？高毒力（high virulence）是指病原体（如细菌、病毒等）引起严重疾病或感染的能力较强，能够更有效地侵入宿主、繁殖、逃避宿主免疫系统并导致显著的组织损伤或疾病症状。在医学和微生物学中，毒力（virulence）是衡量病原体致病能力的一个指标，高毒力通常表现为以下特征：
在上下文中，提到鲍曼不动杆菌（A. baumannii）菌株 HKAB-1 具有高毒力，具体表现为增强的生物膜形成、运动性、干燥耐受性和血清抗性。这些特性使其在宿主环境中（如血清中）存活能力更强，生物膜形成能力增强有助于其在医疗设备或组织表面定植，增加感染的持久性和治疗难度。 简单来说，高毒力意味着病原体更“凶猛”，能更有效地引发严重感染，尤其在免疫力较弱的患者中可能导致更严重的临床后果。
改变表面抗原可以帮助病原体实现免疫逃避的原因在于，宿主免疫系统主要通过识别病原体表面的特定抗原来启动防御反应。表面抗原是病原体（如细菌、病毒）外膜或外壳上的分子（如蛋白质、糖类），它们是免疫系统（尤其是抗体和T细胞）识别和攻击的目标。当病原体改变其表面抗原时，免疫系统可能无法有效识别它，从而使病原体能够逃避免疫清除。以下是具体机制的解释：
宿主免疫系统通过抗体、B细胞和T细胞识别病原体表面的抗原。抗体通常针对特定抗原的独特结构（抗原决定簇）结合，而T细胞通过识别抗原呈递细胞（APC）上的抗原片段来启动反应。 一旦免疫系统识别到特定抗原，就会产生针对该抗原的记忆细胞，以便在未来快速应对相同的病原体。
抗原变异（Antigenic Variation）：病原体通过基因突变或基因重组改变其表面抗原的结构。例如，病毒（如流感病毒）通过“抗原漂移”或“抗原转换”改变其表面蛋白（如血凝素或神经氨酸酶），使之前产生的抗体无法有效结合。 免疫识别失效：当表面抗原发生变化后，宿主已有的抗体或记忆细胞可能无法识别新的抗原变体，导致免疫系统需要重新识别并产生新的抗体，这一过程需要时间，使病原体得以继续繁殖和传播。 逃避中和抗体：抗体通常通过结合病原体表面抗原来中和病原体（如阻止病毒进入细胞）。改变抗原后，抗体无法有效结合，病原体因此能继续感染宿主细胞。
细菌：某些细菌（如奈瑟氏菌）通过相变（phase variation）或基因重组快速改变表面蛋白或多糖结构，逃避宿主抗体。例如，鲍曼不动杆菌（A. baumannii）可能通过改变表面多糖或菌毛蛋白（如 PilA）的结构，降低免疫系统的识别效率。 病毒：流感病毒通过抗原漂移（小规模突变）或抗原转换（大规模基因重组）改变血凝素（HA）或神经氨酸酶（NA），使疫苗或之前的免疫反应失效。 寄生虫：如疟原虫（Plasmodium spp.）通过变异表面抗原（如 PfEMP1）不断改变暴露在红细胞表面的抗原，逃避宿主免疫反应。
菌毛变异：如文中提到的 PilA 变体，HKAB-1 的 IV 型菌毛（T4P）相关基因（如 pilA）表达上调，且其 PilA 蛋白序列与其他菌株不同（非糖基化亚组）。这种变异可能改变菌毛的抗原性，使宿主抗体难以识别。 生物膜保护：生物膜本身可以物理屏蔽表面抗原，减少免疫系统对其的暴露。HKAB-1 增强的生物膜形成能力可能进一步掩盖其表面抗原，降低免疫识别效率。 抗性基因调控：文中提到 adeB 等外排泵基因在生物膜条件下的高表达，可能间接影响表面蛋白的表达或功能，改变病原体与免疫系统的相互作用。
时间优势：免疫系统需要数天至数周来生成针对新抗原的特异性抗体或T细胞反应，而病原体改变抗原的速度通常更快（如细菌的相变或病毒的突变），使其能在免疫反应生效前扩散。 多样性：通过产生多种抗原变体，病原体增加存活概率，因为宿主免疫系统难以同时应对所有变体。 慢性感染：改变表面抗原使病原体能在宿主体内长期存活，形成慢性感染，如鲍曼不动杆菌在医院环境中通过生物膜和抗原变异在医疗设备上持续存在。
总结: 改变表面抗原通过破坏免疫系统对病原体的识别能力，使抗体或T细胞无法有效结合或清除病原体，从而实现免疫逃避。这种策略在高毒力病原体（如 HKAB-1）中尤为重要，因为它结合了抗原变异、生物膜形成等机制，增强了其在宿主环境中的存活和致病能力。这也是为何高毒力菌株在临床上难以控制的原因之一，需要持续监测和开发针对变异抗原的治疗策略（如多价疫苗或广谱抗菌药物）。
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基因组与表型特性研究：一株药物敏感的鲍曼不动杆菌显示出增强的毒力相关特性和应激耐受性
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