基因编辑技术的比较

siRNA沉默： siRNA沉默是一种利用小干扰RNA（siRNA）来降低特定基因表达的方法。siRNA与目标mRNA序列特异性结合，导致mRNA被切割和降解，从而减少相应蛋白的产生。

• 这是一种“转录后沉默”方法，因为它在mRNA水平上阻止基因表达，而不改变DNA序列本身。
• siRNA沉默通常是临时的，只在siRNA存在时有效。
• CRISPR+guideRNA：

CRISPR+guideRNA是一种基因编辑技术，利用CRISPR-Cas9系统通过导向RNA（guideRNA）找到并切割特定的DNA序列。这种切割可以导致DNA的修复机制启动，并在切割位点引入突变，从而永久改变基因的序列。

• 这是一种“基因组水平”的编辑，因为它直接改变DNA序列，这种改变是永久性的。
• CRISPR技术可以用于敲除（完全关闭基因表达）、敲入（引入新的基因序列）或修正（改变现有的基因序列）特定基因。
• 可以将siRNA沉默和CRISPR+guideRNA总结为基因编辑技术，但它们在目标和持久性上有显著区别。

在CRISPR+guideRNA系统中，基因敲除（knockout）通常遵循以下步骤来实现目标基因的失活：

• 设计导向RNA (guide RNA, gRNA)：首先，需要设计一个与目标基因特定区域（通常是编码区或功能区）互补的gRNA。gRNA的设计至关重要，因为它决定了CRISPR系统的Cas9酶将在哪里切割DNA。gRNA需要高度特异性，以避免在非目标位点发生切割（即“脱靶效应”）。
• 构建CRISPR-Cas9载体：将gRNA和Cas9酶的编码序列克隆到适当的载体中。这个载体可以是质粒、病毒或其他传递系统，依据实验的类型和目标细胞类型而定。
• 细胞转染：将CRISPR-Cas9载体引入目标细胞。这可以通过多种方法完成，包括电穿孔、脂质体介导转染、病毒载体传递等。
• DNA切割和修复：一旦进入细胞，Cas9酶会被gRNA引导到目标DNA序列，并在该位置产生双链断裂（DSB）。细胞会尝试修复这种断裂，主要通过两种机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ过程常常不精确，通常会在断裂点引入插入或缺失（indels），从而破坏目标基因的读码框，导致功能性基因产物的缺失。
• 筛选和验证：筛选已经转染的细胞，以找到那些成功进行基因敲除的细胞。这通常涉及PCR、测序、蛋白表达水平分析等方法来验证gRNA和Cas9是否成功地敲除了目标基因。
• 功能分析：一旦确认基因已被成功敲除，接下来就是评估这种基因失活对细胞功能的影响。这可能包括观察细胞生长、分化、迁移、信号传导变化等多方面。
• 精确基因编辑：对于精确基因编辑，如插入新基因或编辑基因内特定核苷酸，科学家使用不同的修复机制，称为同源定向修复（HDR）。在HDR中，提供了一个带有期望DNA序列的修复模板，与CRISPR-Cas9组件一起使用。这个模板具有与Cas9切割位点两侧区域同源的序列。当细胞使用HDR途径修复DSB时，它可以将修复模板中的确切序列整合到基因组中。这个过程允许精确基因编辑，因为模板中指定的新基因或核苷酸变化可以准确地插入到DSB位点。然而，HDR的效率比NHEJ低，并且其效率可能因细胞类型和条件而异。因此，实现精确基因编辑需要仔细设计修复模板，并且通常需要广泛筛选编辑过的细胞，以识别发生期望编辑的细胞。

• 期望DNA序列的修复模板通常以双链DNA (dsDNA) 形式存在，但也可以是单链DNA (ssDNA)。这些模板被设计为包含目标基因编辑位点附近特定序列的同源区域（即与目标基因组中的特定区域具有高度序列同源性）。这些同源区域使得模板能够被细胞的修复机制识别并用于修复CRISPR-Cas9系统引起的DNA双链断裂。具体来说，修复模板的结构通常如下：

  • 双链DNA (dsDNA) 模板：这是一种常见的模板形式，包括目标位点两侧的同源臂（通常各自长几百到几千个碱基），以及中间的改变区域（比如一个新的基因插入位点或者一个点突变）。这种类型的模板用于同源定向修复（HDR），适用于精确插入、删除或替换基因序列。
  • 单链DNA (ssDNA) 模板：相对于dsDNA模板，ssDNA模板通常用于较小的编辑，如单个或少数几个碱基的更改。它们比双链模板更容易渗透细胞，并且在某些情况下可能提供更高的编辑效率。单链模板也包含目标位点附近的同源区域和所需的基因变化。
  • 修复模板可以通过各种方法制备，包括化学合成、聚合酶链反应（PCR）扩增或分子克隆技术。在进行CRISPR-Cas9介导的基因编辑实验时，这些模板与CRISPR-Cas9系统一起引入目标细胞，以指导精确的基因修复过程。

除了siRNA沉默和CRISPR+guideRNA之外，还有其他几种基因编辑技术：

• Zinc Finger Nucleases（ZFNs）：这是一种早期的基因编辑技术，利用锌指蛋白识别特定DNA序列并将其切割，从而引入基因变化。
• TALENs（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）：与ZFNs类似，TALENs技术利用定制的蛋白质来识别特定的DNA序列并切割它，引起基因的修改。
• Prime Editing：这是一种新的基因编辑策略，结合了CRISPR-Cas9系统的定向性和一个逆转录酶，可以在不引入DNA双链断裂的情况下引入精确的基因变化。

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